IB生物作為一門(mén)科學(xué)與實(shí)踐類(lèi)學(xué)科，對(duì)于學(xué)生實(shí)驗(yàn)?zāi)芰Φ目疾煊兄容^高的比重，考試中也會(huì)涉及實(shí)驗(yàn)操作和筆試。今天A加未來(lái)小編就和大家分析IB生物課程中比較經(jīng)典的一個(gè)實(shí)驗(yàn)方法——免疫沉淀方法。
 

 

　　基本實(shí)驗(yàn)步驟

 

　　（1）收獲細(xì)胞，加入適量細(xì)胞IP裂解緩沖液（含蛋白酶抑制劑），冰上或者4℃裂解30min,12,000g離心30 min后取上清；

 

　　（2）取少量裂解液以備Western blot分析，剩余裂解液將1μg相應(yīng)的抗體和10-50μl protein A/G-beads加入到細(xì)胞裂解液，4°C緩慢搖晃孵育過(guò)夜；

 

　?。?）免疫沉淀反應(yīng)后，在4°C以3,000 g速度離心5 min,將protein A/G-beads離心至管底；將上清小心吸去，protein A/G-beads用1ml裂解緩沖液洗3-4次；最后加入15μl的2×SDS加樣緩沖液，沸水煮10分鐘；

 

　?。?）SDS-PAGE,Western blotting或進(jìn)行質(zhì)譜分析。

 

　　一、樣品處理：

 

　　免疫沉淀實(shí)驗(yàn)成功與否，第一步處理樣品非常關(guān)鍵。

 

　　免疫沉淀實(shí)驗(yàn)本質(zhì)上是處于天然構(gòu)象狀態(tài)的抗原和抗體之間的反應(yīng)，而樣品處理的質(zhì)量決定了抗原抗體反應(yīng)中的抗原的質(zhì)量，濃度以及抗原是否處于天然構(gòu)象狀態(tài)。

 

　　所以制備高質(zhì)量的樣品以用于后續(xù)的抗體-agarose beads孵育對(duì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)是否成功非常關(guān)鍵。在這個(gè)環(huán)節(jié)中，除了要控制所有操作盡量在冰上或者4°完成外，最為關(guān)鍵的是裂解液的成份。

 

　　用于免疫沉淀實(shí)驗(yàn)的樣品一般是原代培養(yǎng)細(xì)胞裂解液或者細(xì)胞系裂解液。我們以常用的RIPA裂解液為例（主要含有pH7.4左右的離子緩沖液，接近生理濃度下的NaCl,一定比例的去垢劑和甘油以及各類(lèi)蛋白酶抑制劑等）來(lái)說(shuō)明其各主要成份的用途，進(jìn)而幫助我們?nèi)绾吾槍?duì)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮筒煌牡鞍踪|(zhì)特性來(lái)選擇最佳的裂解液。

 

　　a.緩沖液：離子緩沖液常采用pH7.4的Hepes或者Tris-Cl。

 

　　b.NaCl濃度一般習(xí)慣用150 mM,這主要是因?yàn)?50 mM接近生理濃度，不會(huì)破壞蛋白質(zhì)之間的相互作用。然而細(xì)胞內(nèi)部的NaCl濃度并不是均一的，局部NaCl的濃度可以低到50 mM,150 mM的NaCl有可能會(huì)破壞這個(gè)區(qū)域的蛋白質(zhì)相互作用。因此裂解液配方最佳的NaCl濃度要視所分析的蛋白的亞細(xì)胞定位而定。

 

　　c.甘油由于其粘性，可以對(duì)蛋白質(zhì)之間的相互作用起到一個(gè)很好的保護(hù)作用。一般添加10%的甘油有助于穩(wěn)定蛋白質(zhì)之間的相互作用。

 

　　d.裂解液中的去垢劑可以裂解細(xì)胞質(zhì)膜，也同時(shí)破壞了許多細(xì)胞器的膜，從而釋放了其中儲(chǔ)存的許多蛋白酶。

 

　　而由于用于免疫沉淀實(shí)驗(yàn)的去垢劑作用比較溫和，因此蛋白酶的活性大部分得以保存。還有一部分蛋白酶來(lái)自胞質(zhì)中，主要由于其抑制蛋白或者其活性抑制環(huán)境受到改變后從而恢復(fù)了蛋白酶活性。因此，添加蛋白酶抑制劑對(duì)于防止目的蛋白的降解從而完成免疫沉淀實(shí)驗(yàn)非常關(guān)鍵。一般主要通過(guò)添加EDTA抑制金屬蛋白酶，通過(guò)Protease Cocktail（多種蛋白酶抑制劑混合物）可以抑制蛋白酶。

 

　　e.去垢劑對(duì)于免疫沉淀實(shí)驗(yàn)尤其是免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)是一個(gè)非常關(guān)鍵的因素。不同的去垢劑種類(lèi)和不同的去垢劑濃度主要通過(guò)影響以下三個(gè)因素來(lái)影響免疫沉淀效果：

 

　　-細(xì)胞質(zhì)/器膜的通透性：因?yàn)樵S多目的蛋白都定位在細(xì)胞器中，所以必須先將這些蛋白釋放出來(lái)，抗體才能與之反應(yīng)。

 

　　-膜蛋白的釋放：許多膜蛋白的構(gòu)象對(duì)去垢劑種類(lèi)和濃度非常敏感，因此針對(duì)這類(lèi)蛋白的免疫沉淀實(shí)驗(yàn)，需要謹(jǐn)慎地嘗試多種去垢劑以及不同濃度。

 

　　-蛋白相互作用：不同去垢劑對(duì)不同性質(zhì)的蛋白質(zhì)的相互作用影響程度不一樣，需要根據(jù)具體蛋白的特性進(jìn)行分析選擇去垢劑種類(lèi)和濃度。而由于何種去垢劑適應(yīng)作用于何種蛋白質(zhì)現(xiàn)在很難精準(zhǔn)預(yù)測(cè)，所以一個(gè)更為切實(shí)可行的辦法就是通過(guò)具體實(shí)驗(yàn)篩選合適的去垢劑種類(lèi)和濃度。

　　以上就是A加小編關(guān)于IB生物課程實(shí)驗(yàn)部分中的免疫沉淀法介紹，大家是不是已經(jīng)都完全掌握了呢？更多IB生物學(xué)習(xí)指導(dǎo)問(wèn)題，歡迎練習(xí)A加未來(lái)線上老師進(jìn)行咨詢(xún)和解答。